El RNA no codificante largo B3GALT5-AS1 suprime las metástasis hepáticas por cáncer de colon mediante la supresión de los microRNA-203

El RNA no codificante largo B3GALT5-AS1 suprime las metástasis hepáticas por cáncer de colon mediante la supresión de los microRNA-203

Traducción de artículo científico

Liang Wang^1,*, Zhewei Wei^1,*, Kaiming Wu¹, Weigang Dai¹, Changhua Zhang¹, Jianjun Peng¹, Yulong He¹

Departamento de Cirugía Gastrointestinal, The First Affiliated Hospital, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

*Contribución equivalente     

Palabras clave: RNA no codificante largo, cáncer de colon, metástasis hepática, microRNA, transición epitelio mesenquimal

Artículo original: Long noncoding RNA B3GALT5-AS1 suppresses colon cancer liver metastasis via repressing microRNA-203, publicado el 10 de diciembre de 2018 en www.aging-us.com. Aging 2018, Vol. 10. DOI: https://doi.org/10.18632/aging.101628

Derechos de autor: Wang et al. Este  artículo es de acceso abierto distribuido de acuerdo con la Licencia de Reconocimiento Creative Commons (CC BY 3.0), que permite uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que se acredite su fuente y autor original.

Resumen

Los RNA no codificantes largos (lncRNA) están relacionados con varios tipos de cáncer, entre ellos el cáncer de colon. Las metástasis hepáticas son la causa principal de muerte relacionada con el cáncer de colon. Sin embargo, aún no están claras las funciones que desempeñan los lncRNA en las metástasis hepáticas por cáncer de colon. En este estudio hemos identificado un nuevo lncRNA B3GALT5-AS1, cuya expresión se encuentra reducida en los tejidos de cáncer de colon y aún más reducido en los tejidos hepáticos metastásicos por cáncer de colon.  La expresión reducida de B3GALT5-AS1 se asocia con las metástasis hepáticas y con un pronóstico desfavorable de los pacientes con cáncer de colon.  Los análisis de pérdida y ganancia de función indican que B3GALT5-AS1 inhibió la proliferación, pero propició la migración e invasión de células de cáncer de colon. Estudios posteriores mostraron que B3GALT5-AS1 unido directamente con el  promotor de miRNA-203, reprimió la expresión miR-203, aumentó las dianas miR-203 ZEB2 y SNAI2 e indujo la transición epitelio mesenquimal (TEM).  Los estudios in vivo indicaron que B3GALT5-AS1 suprimía las metástasis hepáticas de cáncer de colon mediante su unión con el promotor miR-203 y la represión de miR-203. También se observó que miR-203 se encontraba aumentado y el fenotipo epitelial era el más notable en los tejidos metastásicos hepáticos por cáncer de colon.  En conjunto, nuestros datos mostraron las funciones supresoras del eje regulador de B3GALT5-AS1/miR-203/TEM en las metástasis hepáticas por cáncer de colon. Nuestros datos indican que la activación del eje B3GALT5-AS1/miR-203/TEM puede derivar en una estrategia para el tratamiento de las metástasis hepáticas por cáncer de colon.

Introducción

El cáncer de colon se encuentra entre las neoplasias y causas de muerte relacionadas con el cáncer más frecuentes mundialmente⁽¹⁾.  Las metástasis a distancia, especialmente las metástasis hepáticas, suponen la principal causa de muerte de los pacientes con cáncer de colon⁽²⁾. La mayoría de los pacientes de cáncer de colon con metástasis hepáticas no son candidatos a cirugía⁽³⁾. Además, hay una carencia de tratamientos efectivos para pacientes de cáncer de colon con metástasis hepáticas⁽⁴⁾. Por tanto, el pronóstico de cáncer de colon con metástasis hepáticas es muy desfavorable con una tasa de supervivencia a los 5 años del 10 al 15%⁽⁵⁾. Esto demuestra la necesidad apremiante de descubrir los mecanismos moleculares precisos en la formación de las metástasis hepáticas por cáncer de colon y de desarrollar tratamientos más efectivos contra estas.

Las metástasis hepáticas por cáncer de colon se forman en un proceso complejo de fases múltiples⁽⁶⁾. Muchas moléculas participan de forma contradictoria en el proceso^(7,8). La mayor parte de los detalles del mecanismo molecular que median en este proceso no está aclarada⁽⁹⁾. La transición epitelio mesénquima (TEM) tiene una función esencial durante la formación de metástasis hepáticas por cáncer de colon^(10,11). La TEM permite la migración e invasión de varias células tumorales, lo cual beneficia la invasión inicial de cánceres primarios⁽¹²⁾.

La TEM también puede reducir la capacidad proliferativa de las células cancerosas⁽¹³⁾. En los sitios metastásicos distantes, las células cancerosas diseminadas requieren transición mesénquimo epitelial (TME), un proceso inverso de TEM para su implantación y crecimiento. La TME permite a las células metastásicas adquirir el fenotipo epitelial y colonizar órganos distantes^(14-16). Se ha informado que el marcador epitelial cadherina-E se encuentra elevado en las metástasis de los nódulos linfáticos y en las metástasis a distancia, en comparación con los tumores primarios⁽¹⁷⁾. Por tanto, identificar los reguladores necesarios de TEM y TME durante la cascada metastásica en el hígado por cáncer de colon beneficia la elección del tratamiento apropiado contra la metástasis hepática por cáncer de colon.

Las secuenciaciones genómicas y transcriptómicas han demostrado que, aunque el 70% del genoma humano transcribe moléculas de RNA, solo cerca de un 2% del genoma humano codifica proteínas⁽¹⁸⁾. Por tanto, la mayor parte del transcriptoma humano es RNA no codificante⁽¹⁹⁾.  Muchos de estos RNA no codificantes tienen una función reguladora esencial en los cánceres⁽²⁰⁾. El RNA no codificante largo (lncRNA) es un tipo de transcripto de RNA con capacidad limitada de codificación protéica, superior a los 200 nucleótidos de extensión⁽²¹⁾. Las pruebas acumuladas disponen que los lncRNA generalmente se desregulan en diversos estados patológicos y cumplen funciones importantes en varios procesos patofisiológicos^(22-27). En cuanto al cáncer de colon, se han descubierto varios lncRNA que regulan la proliferación de células del cáncer de colon, apoptosis, migración, invasión, quimorresistencia y demás, tales como lncRNA N-BLR, GAS5, HNF1A-AS1, CRNDE, LINC01133^(28-32). No obstante, aún se desconocen en gran medida las funciones que desempeñan el lncRNA y el TEM en las metástasis hepáticas por cáncer de colon.

El microRNA (miRNA) es otro tipo de transcripto de RNA no codifiante, con 20-25 nucleótidos de extensión⁽³³⁾. De forma similar, se ha informado del importante papel regulador del miRNA durante diversos procesos patofisiológicos^(36-38). Varios miRNA son reguladores de la TEM bien conocidos que reprimen los factores de transcripción inductores de la TEM^(39,40). Se ha informado que la familia miR-200 inhibe la TEM mediante la represión directa de ZEB1 y ZEB2^(39,41-43). Se ha informado que miR-203 inhibe la TEM mediante la represión de ZEB2 y SNAI2^{(44, 45)}. Sin embargo, miR-203 tiene papeles diferentes en cánceres diferentes^{(40, 46-49)}. Se ha descubierto que miR-203 ejerce funciones supresoras de tumores en el cáncer de próstata, el de pulmón, el nasofaríngeo y el colorrectal^(50-52). También se ha descubierto que miR-203 se encuentra aumentado en los tejidos afectados por cáncer colorrectal, en comparación con la mucosa adyacente normal⁽⁴⁶⁾.  Además, se ha descubierto que miR-203 se encuentra elevado en el tejido de las metástasis hepáticas por cáncer colorrectal, en comparación con los tejidos de cáncer colorrectal primario⁽⁴⁶⁾. Un meta análisis indicó que la elevación de miR-203 acusa peor pronóstico en el cáncer colorrectal ⁽⁴⁹⁾. Estos resultados controvertidos sugieren que se precisan más estudios sobre la expresión y las funciones de miR-203 en la TEM y en las metástasis hepáticas por cáncer de colon.

En este estudio, mediante el uso de un catálogo de datos públicos disponibles de RNA-seq de cáncer de colon, hemos identificado que incRNA B3GALT5-AS1 se encuentra reducido en los tejidos de cáncer de colon, y aún más reducido en el tejido de las metástasis hepáticas por cáncer de colon. Seguidamente confirmamos el patrón de expresión B3GALT5-AS1 en cáncer de colon y en las metástasis hepáticas de materiales clínicos. Por otra parte, confirmamos la correlación negativa entre miR y los patrones de expresión B3GALT5-AS1 en las metástasis hepáticas por cáncer de colon. Además, se exploraron las funciones biológicas de B3GALT5-AS1 y de miR-203 en la TEM y en metástasis hepáticas por cáncer de colon mediante experimentos de análisis de pérdida y ganancia de función.

Resultados

B3GALT5-AS1 es más bajo en cáncer de colon y aún más en los tejidos metastásicos hepáticos

Al analizar el RNA-seq del catálogo de datos GSE50760, que contiene 18 epitelios normales de colon, 18 cánceres primarios colorrectales y 18 cánceres metastásicos al hígado, hemos observado que el lncRNA B3GALT5-AS1 (C21orf88) se encuentra reducido en cánceres colorrectales primarios en comparación con el epitelio normal de colon y se encuentra todavía más reducido en los cánceres metastásicos al hígado. Para seguir con la exploración del patrón de expresión B3GALT5-AS1 en el cáncer de colon humano, reunimos 64 pares de tejidos de cáncer de colon primario y de sus correspondientes tejidos epiteliales de colon adyacentes. Mediante una búsqueda en el National Center for Biotechnology Information (NCBI), encontramos dos variantes de transcripción de B3GALT5-AS1. Los resultados de qRT-PCR mostraron que la variante de descripción 2 (referencia de la secuencia NCBI: NR 026543.1) es el principal transcripto de B3GALT5-AS1 en ambos tejidos, de colon normal y cancerígeno (figura S1). Además, la variante de transcripción 2 se encuentra reducida en el cáncer de colon mientras que la variante de transcripción 1 no muestra una diferencia significativa entre los tejidos de cáncer de colon y los tejidos de epitelio de colon normal (figura S1). Por tanto, concentramos nuestra atención en la variante de transcripción 2 de B3GALT5-AS1.

La expresión de B3GALT5-AS1 en 64 pares de tejidos de cáncer de colon primario y los tejidos de epitelio de colon normales se midieron mediante qRT-PCR. Según se expone en la figura 1B, B3GALT5-AS1 está marcadamente reducido en los tejidos de cáncer de colon primario, en comparación con los tejidos de epitelio de colon normales. Los análisis sobre la relación entre la expresión de B3GALT5-AS1 y las facetas clinicopatológicas del cáncer de colon mostraron que una menor expresión de B3GALT5-AS1 se correlaciona con un mayor tamaño tumoral, metástasis a distancia y un estado más avanzado en la escala AJCC de estadificación.

Estadios del AJCC (tabla 1). Para confirmar la relación entre la expresión B3GALT5-AS1 y las metástasis a distancia, reanalizamos la expresión B3GALT5-AS1 en los tejidos de cáncer de colon con (n = 15) o sin (n = 49) metástasis. El resultado  mostró que B3GALT5-AS1 está disminuido de forma significativa en los tejídos de cáncer de colon primario con metástasis en comparación con los tejidos sin metástasis (figura 1C). Para estos 15 cánceres de colon con metástasis, observamos sus correspondientes tejidos de metástasis hepáticas.  La expresión de B3GALT5-AS1 en estos 15 pares de cáncer de colon primario y sus correspondientes tejidos de metástasis hepáticas se midió mediante 1RT-PCR.

Según se muestra en la figura 1D, B3GALT5-AS1 se encuentra marcadamente reducido en los tejidos de metástasis hepáticas, en comparación con los tejidos de cáncer de colon primarios. El análisis de supervivencia Kaplan-Meier de estos 64 pacientes de cáncer de colon mostró que los pacientes de cáncer de colon con una expresión inferior de B3GALT5-AS1 lograron una menor supervivencia que aquellos con una expresión superior de B3GALT5-AS1 (figura 1E). Por otra parte, la expresión B3GALT5-AS1 en la línea de epitelio normal de colon NCM460 y de células cancerosas de colon en las líneas HCT116, HT-29, LoVo, SW480 y SW620 se midió mediante 1RT-PCR. Según se aprecia en la figura 1F, B3GALT5-AS1 se encontraba significativamente reducido en las líneas de células cancerosas de colon en comparación con la línea de células epiteliales normales de colon. Estos datos sugieren que B3GALT5-AS1 se encuentra reducido en el cáncer de colon y aún más reducido en los tejidos metastásicos hepáticos. La expresión reducida de B3GALT5-AS1 indica un pronóstico desfavorable del cáncer de colon.

Tabla 1. Correlación entre la expresión B3GALT5-AS1 y las facetas clinicopatológicas de los cánceres de colon.

B3GALT5-AS1 suprime la proliferación celular en cáncer de colon.

Para explorar los efectos de B3GALT5-AS1, aumentamos la expresión de B3GALT5-AS1 de forma estable en células HCT116 mediante la transfección del plásmido de expresión aumentada (figura 2A) y silenciamos de forma estable B3GALT5-AS1 en células SW620 mediante la transfección de dos shRNA independientes contra B3GALT5-AS1 (figura 2B). Las pruebas de viabilidad celular Glo mostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 reducía la viabilidad celular notablemente mientras que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 aumentaba significativamente la viabilidad celular de las células de cáncer de colon.

Los ensayos de incorporación EdU además mostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 suprimía notablemente la proliferación celular,  mientras que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 promovía notablemente la proliferación de células de cáncer de colon (figura 2E, F). Dado que B3GALT5-AS1 se encuentra en una expresión aumentada en la línea celular NCM460 de epitelio de colon normal, seguidamente determinamos los efectos del silenciamiento de B3GALT5-AS1 sobre la viabilidad y proliferación celular de NCM460, mediante el ensayo de viabilidad celular Glo y el ensayo de incorporación EdU. Según se expone en la figura S2A-C, el silenciamiento transitorio de B3GALT5-AS1 también promovía la proliferación celular de NCM460. En conjunto, estos datos sugieren que B3GALT5-AS1 suprime la viabilidad celular y la proliferación celular del cáncer de colon y de las células epiteliales del colon.

Figura 2. B3GALT5-AS1 suprime la proliferación de células de cáncer de colon. (A) La expresión de B3GALT5-AS1 en B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y en las células testigo HCT116 se detectó mediante qRT-PCR. (B) La expresión de B3GALT5-AS1, en B3GALT5-AS1 con inhibición estable y de las células testigo SW620 se detectó mediante qRT-PCR. (C) La viabilidad celular de B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y de las células testigo HCT116 se detectó mediante ensayo de viabilidad celular Glo. (D) La viabilidad celular de B3GALT5-AS1 con inhibición estable y de las células testigo SW620 se detectó mediante ensayo de viabilidad celular Glo. (E) La proliferación celular de B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y de las células testigo HCT116 se detectó mediante ensayo de incorporación EdU. El color rojo indica células EdU positivas. Escala de barras = 100 μm. (F) La proliferación celular de B3GALT5-AS1 con inhibición estable y de las células testigo SW620 se detectó mediante ensayo de incorporación EdU. El color rojo indica células EdU positivas. Escala de barras = 100 μm. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. **P < 0,01, ***P < 0,001, prueba t de Student.

B3GALT5-AS1 promueve la migración, invasión y la TEM de células cancerosas de colon

Seguidamente exploramos el papel que desempeña de B3GALT5-AS1 en la migración e invasión de células cancerosas de colon. Los ensayos de migración Transwell mostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 promovía migración celular, mientras que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 inhibía la migración celular de las células cancerosas de colon (figuras 3A, B). Los ensayos de invasión Transwell mostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 promovía la invasión, mientras que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 reprimía la invasión de células cancerosas de colon (figuras 3C, D). De manera similar, el silenciamiento de B3GALT5-AS1 también reprimía la migración e invasión de células NCM460 (figuras S2D, E). Los efectos opuestos de B3GALT5-AS1 sobre la proliferación, la migración y la invasión celular implican que la TEM pueda mediar en el papel de B3GALT5-AS1 en el cáncer de colon.

Así que seguimos explorando el papel de B3GALT5-AS1 en la TEM de las células cancerosas de colon. El resultado mostró que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 reducía la expresión del marcador epitelial cadherina-E y aumentó el marcador mesenquimal cadherina-N (figura 3E-F), lo cual sugiere que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 inducía la expresión aumentada de la TEM de las células cancerosas de colon. El silenciamiento de B3GALT5-AS1 aumentó la expresión de cadherina-E y disminuyó la cadherina-N (figura 3G, H), lo cual sugiere que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 reprimió la TEM de las células cancerosas de colon. De forma similar, el silenciamiento de B3GALT5-AS1 también reprimió la TEM de células NCM460 (figura S2F). Estos datos demostraron que B3GALT5-AS1 promueve la migración, invasión y TEM del cáncer de colon y de las células epiteliales de colon.

Figura 3. B3GALT5-AS1 promovió la migración, la invasión y la TEM de las células cancerosas de colon. (A) La migración celular de B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y de las células testigo HCT116 se detectó mediante ensayo de migración Transwell. Escala de barras = 100 μm. (B) La migración celular de B3GALT5-AS1 con inhibición estable y  de las células testigo SW620 se detectó mediante ensayo de migración Transwell. Escala de barras = 100 μm. (C) La invasión celular de B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y de las células testigo HCT116 se detectó mediante ensayo de invasión Transwell. Escala de barras = 100 μm. (D) La invasión de B3GALT5-AS1 con inhibición estable y de las células testigo SW620 se detectó mediante ensayo de invasión Transwell. Escala de barras = 100 μm. (E) La cadherina-E y la cadherina-N a nivel de RNAm en B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y en las células testigo HCT116 se detectaron mediante 1RT-PCR. (F) La cadherina-E y la cadherina-N a nivel proteico de B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y de las células testigo HCT116 se detectaron mediante inmunotransferencia. (G) La cadherina-E y la cadherina-N a nivel de RNAm en B3GALT5-AS1 con inhibición estable y en las células testigo SW620 se detectaron mediante qRT-PCR. (H) La cadherina-E y la cadherina-N a nivel protéico en B3GALT5-AS1 con silenciamiento estable y en las células de testigo SW620 se detectaron mediante inmunotransferencia. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *P < 0.05, **P < 0.01, prueba t de Student.

Figura 4. B3GALT5-AS1 se unió al promotor de miR-203 y reprimió la expresión de miR-203. (A) La distribución subcelular de B3GALT5-AS1 en las fracciones citoplasmáticas y nucleares de las células HCT116 se examinó mediante el aislamiento citoplasmático y nuclear del RNA seguido por qRT-PCR. Se usó β-actina y U6 como testigo citoplasmático y nuclear, respectivamente. (B) Esquema sencillo de las zonas de interacción predictiva entre B3GALT5-AS1 y el promotor de miR-203. (C) La expresión de miR-203 en B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y en las células testigo HCT116 se detectó mediante qRT-PCR. (D) La expresión de miR-203 en B3GALT5-AS1 con inhibición estable y en las células testigo SW620 se detectó mediante qRT-PCR. (E) Se realizaron ensayos ChIRP en las células HCT116 con sondas antisentido específicas para B3GALT5-AS1 o LacZ (testigo negativo). El DNA enriquecido se midió mediante qRT-PCR con cebadores específicos contra el promotor miR-203. (F) Boceto esquemático de los diferentes transcriptos de disminución obtenidos de B3GALT5-AS1. (G) Tras las transfecciones transitorias de los diversas plásmidos de expresión B3GALT5-AS1 introducidos en las células HCT116, se midió la expresión de miR-203 mediante qRT-PCR. (H) Tras la cotransfección transitoria con el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga que contenía el promotor de miR-203, el plásmido pRL-TK de expresión renilla luciferasa y los plásmidos de las diversas expresiones B3GALT5-AS1 introducidos en las células HCT116, se detectó actividad luciferasa mediante Dual Luciferase Reporter Assay. Los resultados se exponen como tasa relativa de la actividad luciferasa de luciérnaga frente a la actividad renilla luciferasa.(I) Tras la cotransfección transitoria con el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga que contenía el promotor de miR-203 y pRL-TK en B3GALT5-AS1 con inhibición estable y células testigo SW620, la actividad luciferasa se midió mediante Dual Luciferase Reporter Assay. Los resultados se exponen como tasa relativa de la actividad luciferasa de luciérnaga frente a la actividad renilla luciferasa. (J) Tras la transfección transitoria de los diversos plásmidos de expresión B3GALT5-AS1 introducidos en células HCT116, la expresión de ZEB2 y SNAI2 se detectó mediante qRT-PCR y western blot. (K) La expresión de ZEB2 y de SNAI2 en B3GALT5-AS1 con inhibición estable y en las células testigo SW620 se detectó mediante qRT-PCR y western blot. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. **P < 0.01, ***P < 0.001, NS, no significativo, prueba t de Student.

B3GALT5-AS1 se une directamente al promotor de miR-203 e inhibe la expresión de miR-203

Para estudiar el mecanismo subyacente que media en las funciones de B3GALT5-AS1 respecto al cáncer de colon, primero hemos confirmado la distribución subcelular de B3GALT5-AS1 en las células cancerosas de colon mediante la purificación citoplasmática y de RNA nuclear. Según expuesto en la figura 4A, B3GALT5-AS1 se encontraba localizado de forma predominante en el núcleo. Se ha informado que varios miRNA están involucrados en la TEM⁽¹¹⁾. Se ha informado que miR-203, la familia miR-200 (incluidos miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141, miR-429), miR-34a y miR-9 inhiben la TEM^{(11, 44)}. Se ha informado que miR-29a promueve la TEM. Por tanto, predijimos los efectos potenciales de B3GALT5-AS1 sobre estos miRNA mediante la búsqueda de potenciales sitios de unión de B3GALT5-AS1 con los promotores de estos miRNA, mediante BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Según muestra la figura S3, el promotor de miR-203 tiene el mayor potencial de unión con B3GALT5-AS1. La zona de interacción cubre de 1062 a 1363 nucleótidos de B3GALT5-AS1 (figura 4B). Entonces estudiamos si B3GALT5-AS1 regula la expresión de miR-203 en las células cancerosas de colon. Los resultados de qRT-PCR mostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 suprimió de forma significativa la expresión de miR-203, mientras que la disminución de B3GALT5-AS1 aumentaba notablemente la expresión de miR-203 (figuras 4C, D). Los ensayos ChIRP mostraron que el promotor de miR-203 estuvo enriquecido específicamente por las sondas antisentido B3GALT5-AS1 (figura 4E). Seguidamente, expresamos los fragmentos truncados de B3GALT5-AS1 con o sin los sitios de unión, que codifican de 1062 a 1363 nucleótidos o de 1 a 1061 nucleótidos de B3GALT5-AS1 respectivamente (figura 4F). Las transfecciones transitorias de plásmidos con expresión B3GALT5-AS1 de longitud completa o truncados en células HCT116 mostraron que la disminución de los sitios de unión suprimieron el papel represivo de B3GALT5-AS1 sobre la expresión miR-203, mientras que solo los sitios de unión de B3GALT5-AS1 pudieron reprimir de forma suficiente la expresión miR-203 (figura 4G). Estos resultados sugieren que los sitios de unión son responsables de los efectos de B3GALT5-AS1 sobre miR-203. Para estudiar a continuación si B3GALT5-AS1 regula la actividad promotora de miR-203, clonamos el promotor de miR-203 que contenía la zona de unión en un reportero de la luciferasa. Los ensayos de luciferasa mostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 disminuye de forma significativa la actividad promotora de miR-203, que fue suprimida por la disminución de los sitios de unión de B3GALT5-AS1, mientras solo los sitios de unión de B3GALT5-AS1 podrían disminuir la actividad promotora de miR-203 de forma suficiente (figura 4H).

A la inversa, el silenciamiento de B3GALT5-AS1 aumentó significativamente la actividad promotora de miR-203 (fig. 4I). Se ha informado que miR-203 inhibe la TEM mediante la represión de la expresión de los factores de transcripción ZEB2 y SNAI2, inductores de la TEM ^{(44, 45)}.

Por tanto, seguimos el estudio de las funciones de B3GALT5-AS1 sobre las dianas ZEB2 y SNAI2 de miR-203. Las transfecciones transitorias de los diversos plásmidos de expresión de B3GALT5-AS1 en las células HCT116 demostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 aumentó ZEB2 y SNAI2, que fueron suprimidos mediante la disminución de los sitios de unión de B3GALT5-AS1, ya que solo los sitios de unión de B3GALT5-AS1 pudieron aumentar ZEB2 y SNAI2 de forma suficiente (figura 4J). A la inversa, el silenciamiento de B3GALT5-AS1 redujo ZEB2 y SNAI2 (figura 4K). Todos estos resultados sugerían que B3GALT5-AS1 inhibía miR-203 y aumentaba las dianas ZEB2 y SNAI2 de miR-203 mediante la interacción con el promotor de miR-203.

miR-203 se encuentra aumentado en el cáncer de colon y aún más aumentado en las metástasis hepáticas

Para examinar si la regulación de miR-203 y de la TEM de B3GALT5-AS1 existen in vivo, medimos la expresión de miR-203 en los mismos 64 pares de tejidos de cáncer de colon primario y sus correspondientes tejidos epiteliales de colon adyacentes usados en la figura 1B. Según se muestra en la figura 5A, miR-203 se encontraba marcadamente aumentado en los tejidos de cáncer de colon en comparación con los tejidos de epiteliales de colon. Los análisis de la correlación entre la expresión de B3GALT5-AS1 y miR-203 en estos 64 tejidos de cáncer de colon mostraron que la expresión de miR-203 se correlacionaba inversamente con la de B3GALT5-AS1 en los tejidos de cáncer de colon (figura 5B).  También se detectó la expresión de miR-203 en 15 pares de tejidos de cáncer de colon primario y sus correspondientes metástasis hepáticas usadas en la figura 1D.

Según se muestra en la figura 5C, miR-203 se encontraba aumentado significativamente en los tejidos metastásicos de hígado, en comparación con los tejidos de cáncer de colon primario. Además se midieron las expresiones de ZEB2 y SNAI2 en los mismos 15 pares de tejidos de cáncer de colon primario y sus correspondientes tejidos de metástasis hepáticas. Los resultados mostraron que tanto ZEB2 como SNAI2 se encontraban reducidos en los tejidos metastásicos hepáticos, en comparación con los tejidos de cáncer de colon primario (figuras 5D, E). También se midió la expresión de los marcadores de la TEM, cadherina-E y cadherina-N, en estos pares de tejidos, de cáncer de colon primario y de metástasis hepáticas. Según se muestra en la figura 5F, G, la cadherina-E se encontraba aumentada y mientras, la cadherina-N se encontraba reducida en el tejido metastásico hepático, en comparación con los tejidos con cáncer de colon primario. Estos datos sugerían que miR-203 se encuentra aumentado en el cáncer de colon y más incrementado en los tejidos metastásicos hepáticos, en asociación inversa con B3GALT5-AS1. ZEB2 y SNAI2 se encontraban reducidos y la faceta epitelial prevalecía en los tejidos metastásicos hepáticos.

Figura 5. Patrón de expresión de miR-203 en el cáncer de colon. (A) La expresión miR-203 en 64 pares de tejidos de cáncer de colon y el tejido epitelial de colon adyacente se midió mediante qRT-PCR. P < 0,0001, prueba de rango con Wilcoxon. (B) La correlación entre B3GALT5-AS1 y el nivel de expresión de miR-203 en tejidos de cáncer de colon. n = 64, r = -0,7625, P < 0,0001, prueba de correlación de Pearson. (C) La expresión de miR-203 en 15 pares de tejidos de cáncer de colon y los correspondientes tejidos metastásicos de hígado se midió mediante qRT-PCR.  P < 0,0001, prueba de rango con Wilcoxon. (D) La expresión de ZEB2 en 15 pares de tejidos con cáncer de colon y los correspondientes tejidos metastásicos de hígado se midió mediante qRT-PCR. P = 0,0006, prueba de rango con Wilcoxon. (E) La expresión de SNAI2 en 15 pares de tejidos de cáncer de colon primario y los correspondientes tejidos metastásicos del hígado se midió mediante qRT-PCR. P = 0,0034, prueba de rango con Wilcoxon.  (F) La expresión de la cadherina-E en 15 pares de tejidos de cáncer de colon primario y los correspondientes tejidos metastásicos del hígado se midió mediante qRT-PCR. P < 0,0001, prueba de rango con Wilcoxon. (G) La expresión de la cadherina-N en 15 pares de tejidos de cáncer de colon primario y los correspondientes tejidos metastásicos del hígado se midió mediante qRT-PCR. P = 0,0002, prueba de rango con Wilcoxon.

B3GALT5-AS1 inhibe las metástasis hepáticas por cáncer de colon

Seguidamente evaluamos si B3GALT5-AS1 actúa sobre las metástasis hepáticas por cáncer de colon. Se aumentó de forma estable la expresión de B3GALT5-AS1 con reducción de los sitios de unión en células HCT116 con un nivel de expresión aumentada similar al clon de expresión aumentada B3GALT5-AS1 de longitud normal. El B3GALT5-AS1 con expresión aumentada estable y las células testigo HCT116 se inyectaron a través del bazo para establecer el modelo de metástasis hepáticas en ratones lampiños. Los resultados mostraron que la expresión ectópica de B3GALT5-AS1 disminuía la cantidad de focos metastásicos hepáticos, lo cual fue suprimido mediante la disminución de los sitios de unión (figura 6B). Las expresiones de B3GALT5-AS1 y miR-203 se midieron en los focos metastásicos hepáticos formados por los diversos clones HCT116.

Los resultados confirmaron la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 y la disminución de miR-203 en los focos de metástasis hepáticas formadas por células B3GALT5-AS1 aumentadas de forma estable (figura 6C). La disminución de los sitios de unión suprime los efectos de B3GALT5-AS1 sobre miR-203 in vivo (figura 6C). La tinción inmunohistoquímica para marcador de proliferación Ki67 de los focos metastásicos hepáticos mostró que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 disminuía la proporción de células Ki67 positivas, que habían sido suprimidas mediante la disminución de sitios de unión (figura 6D). Las expresiones de ZEB2 y SNAI2 se midieron en los focos metastásicos hepáticos, y los resultados mostraron que ZEB2 y SNAI2 se encontraban aumentados en los focos metastásicos hepáticos formados por las células B3GALT5-AS1 aumentadas de forma estable, que fueron suprimidas mediante la disminución de los sitios de unión de B3GALT5-AS1 (figura 6E). La expresión de los marcadores de TEM, cadherina-E y cadherina-N, también se midió en los focos metastásicos hepáticos. El resultado mostró que la cadherina-E se encontraba reducida, mientras la cadherina-N estaba aumentada en los focos metastásicos hepáticos formados por las células con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable, que también fueron suprimidas mediante la disminución de los sitios de unión de B3GALT5-AS1 (figura 6F). Todos estos resultados sugieren que B3GALT5-AS1 inhibió miR-203, aumentó ZEB2 y SNAI2, indujo la TEM e inhibió las metástasis hepáticas por cáncer de colon in vivo.

Figura 6. B3GALT5-AS1 inhibía las metástasis hepáticas por cáncer de colon. (A) La expresión de B3GALT5-AS1 en los diversos clones de células HCT116 con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable se midió mediante qRT-PCR. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. ***P < 0.001, prueba t de Student. (B) Las células HCT116 marcadas con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable se introdujeron mediante inyección intraesplénica para establecer metástasis hepáticas. Se determinó la cantidad de focos metastásicos en el higado al día 42 tras la inyección intraesplénica, mediante tinción HE. Escala de barras = 1000 μm. (C) La expresión de B3GALT5-AS1 y de miR-203 en los focos metastásicos hepáticos formado por las células HTC116 marcadas con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable, se detectó mediante qRT-PCR. (D) La tinción inmunohistoquímica para Ki67 en los focos metastásicos hepáticos formados por estas células HCT116 marcadas con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable. Escala de barras = 50 μm. (E) La expresión de ZEB2 y SNAI2 en focos metastásicos hepáticos formados por estas células HCT116 marcadas con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable, se midió mediante qRT-PCR. (F) La expresión de la cadherina-E y la cadherina-N en los focos metastásicos hepáticos formados por estas células HCT116 marcadas con B3GALT5-AS1 aumentado de forma estable, se detectó mediante qRT-PCR. Para B a F, los datos se muestran como media ± desviación estándar de seis ratones en cada grupo. **P < 0.01, NS, no significativo, prueba de Mann-Whitney.

La disminución de B3GALT5-AS1 promueve las metástasis hepáticas por cáncer de colon en dependencia de miR-203

Para estudiar si la inhibición de miR-203 media en el papel de B3GALT5-AS1 en las metástasis hepáticas por cáncer de colon, hemos inhibido de forma estable la expresión de miR-203 en céllulas SW620 con B3GALT5-AS1 disminuido de forma estable (figura 7A).

Los clones celulares construidos se inyectaron s a través del bazo para establecer modelos de metástasis hepáticas en ratones lampiños. Los resultados mostraron que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 aumentó la cantidad de focos metastásicos hepáticos, lo cual fue atenuado mediante la inhibición de miR-203 (figura 7B). La expresión de B3GALT5-AS1 y de miR-203 se midió en los focos metastásicos hepáticos formados por estos clones estables. Los resultados confirmaron la reducción de B3GALT5-AS1 y el aumento de miR-203 en los focos metastásicos hepáticos formados por células con reducción estable de B3GALT5-AS1, y también la inversión de miR-203, en los focos metastásicos hepáticos formados por células con B3GALT5-AS1 y miR-203 simultáneamente reducidos. La tinción inmunohistoquímica para marcador de proliferación Ki67 de los focos metastásicos hepáticos mostró que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 incrementaba la proporción de células Ki67 positivas, lo cual fue atenuado mediante la inhibición de miR-203 (figura 7D). La expresión de ZEB2 y SNAI2 se midió en los focos metastásicos hepáticos y el resultado mostró que ZEB2 y SNAI2 se encontraban disminuidos en los focos metastásicos hepáticos formados por células con B3GALT5-AS1 reducido de forma estable, que fueron abolidas mediante la inhibición de miR-203 (figura 7E). La expresión de los marcadores de la TEM, cadherina-E y cadherina-N, se midió también en los focos metastásicos hepáticos. Los resultados mostraron que la cadherina-E se encontraba aumentada mientras que la cadherina-N se encontraba reducida en los focos metastásicos hepáticos formados por células con B3GALT5-AS1 reducido de forma estable, que también se encontraban suprimidas mediante la inhibición de miR-203 (figura 7F). Todos estos resultados demostraron que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 aumentaba miR-203, disminuía ZEB2 y SNAI2 e inhibía la TEM in vivo.  Estos datos también sugerían que el silenciamiento de B3GALT5-AS1 promovía las metástasis hepáticas por cáncer de colon al menos parcialmente por medio del aumento de miR-203.

Discusión

Las metástasis a distancia, particularmente las metástasis hepáticas, son la principal causa de muerte relacionada con el cáncer de colon ⁽⁴⁾. Sin embargo, se desconocen en gran medida los mecanismos moleculares esenciales que sustentan las metástasis hepáticas por cáncer de colon. En el presente estudio hemos encontrado un nuevo eje de regulación en el proceso de las metástasis hepáticas por cáncer de colon, que es la inducción de la TEM por el lncRNA B3GALT5-AS1 mediante la represión de miR-203. Nuestros datos pusieron de manifiesto que B3GALT5-AS1 se une directamente al promotor de miR-203, reprime la expresión de miR-203, aumenta las dianas de miR-203: ZEB2 y SNAI2, induce la TEM y finalmente inhibe las metástasis hepáticas por cáncer de colon.  En consonancia con el papel inhibidor de B3GALT5-AS1/miR-203/ZEB2-SNAI2/TEM en las metástasis hepáticas por cáncer de colon, B3GALT5-AS1 se encuentra reducido, miR-203 se encuentra aumentado, ZEB2 y SNAI2 se encuentran reducidos, el marcador epitelial cadherina-E se encuentra aumentado, el marcador mesenquimal cadherina-N se encuentra reducido en los tejidos metastásicos hepáticos en comparación con los tejidos de cáncer de colon primario.

En los focos metastásicos hepáticos, las células de cáncer de colon metastatizadas sufren la TME y recuperan el fenotipo epitelial, lo que permite su colonización y proliferación ⁽⁵⁴⁾. Nuestros datos apoyan esta teoría. Nuestros ensayos sobre metástasis hepáticas in vivo demostraron que la expresión aumentada de B3GALT5-AS1 inducía el fenotipo mesenquimal de las células metastatizadas del cáncer de colon e inhibían las metástasis hepáticas del cáncer de colon. La reducción de B3GALT5-AS1 inducía el fenotipo epitelial de las células metastatizadas de cáncer de colon y promovía las metástasis hepáticas del cáncer de colon. Por tanto, las funciones opuestas de la TEM en la invasión temprana y la colonización tardía de los procesos de metástasis hepáticas por cáncer de colon implican la justificación de tratamientos específicos por estadio.

Mecanísticamente, hemos identificado una región larga de interacción con unos 300 nucleótidos entre los últimos 300 nucleótidos de B3GALT5-AS1 y el promotor de miR-203. Las pruebas ChIRP demostraron la unión física entre B3GALT5-AS1 y el promotor de miR-203. Los ensayos de luciferasa y las pruebas de cartografía de disminución mostraron que B3GALT5-AS1 inhibía el promotor de actividad de miR-203, que era dependiente de esta zona de interacción. Consecuentemente, B3GALT5-AS1 reprimía la expresión de miR-203 tanto in vitro como en las células metastatizadas de hígado por cáncer de colon in vivo, que también eran dependientes de la zona de interacción. La correlación inversa entre B3GALT5-AS1 y la expresión de miR-203 en los tejidos de cáncer de colon apoyaba la reducción de miR-203 por B3GALT5-AS1.

Figura 7. La reducción de B3GALT5-AS1 promovía las metástasis hepáticas por cáncer de colon en dependencia de miR-203. (A) La expresión de miR-203 en B3GALT5-AS1 y miR-203, ambos reducidos y las células testigo SW620  midieron mediante qRT-PCR. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. **P < 0.01, prueba t de Student. (B) B3GALT5-AS1 y miR-203, ambos reducidos, y las células testigo SW620 se administraron por inyección intraesplénica para establecer metástasis hepáticas. La cantidad de focos metastásicos hepáticos se detectó el día 42 tras la inyección intraesplénica mediante tinción HE. Escala de barras = 1000 μm. (C) La expresión de B3GALT5-AS1 y miR-203 en los focos metastásicos hepáticos formados por B3GALT5-AS1 y miR-203, ambos reducidos, y células testigo SW620, se detectó mediante qRT-PCR. (D) La tinción inmunohistoquímica de Ki67 en los focos metastásicos hepáticos formados por B3GALT5-AS1 y miR-203, ambos reducidos, y las células testigo SW620. Escala de barras = 50 μm. (E) La expresión de ZEB2 y SNAI2 en los focos metastásicos hepáticos formados por B3GALT5-AS1 y miR-203, ambos reducidos, y las células de testigo SW620 se midió mediante qRT-PCR.  (F) La expresión de la cadherina-E y la cadherina-N en los focos metastásicos hepáticos formados por B3GALT5-AS1 y miR-203, ambos reducidos, y las células testigo SW620, se detectó mediante qRT-PCR. Para B a F, los datos se muestran como media ± desviación estándar de seis ratones en cada grupo. **P < 0.01, prueba de Mann-Whitney.

Además, los ensayos funcionales in vivo demostraron que la inhibición de miR-203 atenuaba el papel prometastásico de la reducción de B3GALT5-AS1 en las metástasis hepáticas por cáncer de colon. Aparte de miR-203, otros reguladores de TEM también podrían ser dianas de reducción de B3GALT5-AS1, que precisan estudios adicionales. Sin contar con la TEM, otros mecanismos podrían mediar en el papel de B3GALT5-AS1 en la proliferación celular del cáncer de colon, que también precisan estudios adicionales. Aun así, nuestros resultados sugerían que la reducción de miR-203 y el aumento de la TEM por parte de B3GALT5-AS1 mediaba, al menos parcialmente, en el papel de B3GALT5-AS1 en las metástasis hepáticas por cáncer de colon.

En resumen, hemos demostrado que el lncRNA B3GALT5-AS1 se encuentra disminuido en los tejidos de cáncer de colon, y aún más reducidos en los tejidos metastásicos hepáticos por cáncer de colon. La expresión reducida de B3GALT5-AS1 indica un pronóstico desfavorable en los pacientes de cáncer de colon. B3GALT5-AS1 inhibe la proliferación, promueve la migración e invasión, induce la TEM e inhibe las metástasis hepáticas por células de cáncer de colon mediante la represión de miR-203. Nuestros datos sugerían que el eje B3GALT5-AS1/miR-203/TEM puede ser una diana de tratamiento para las metástasis hepáticas por cáncer de colon.

Material y método

Paciente y muestras de tejido

Se tomaron 64 pares de tejidos cáncer de colon primario y tejido epitelial adyacente de colon normal, y 15 tejidos metastásicos hepáticos por cáncer de colon, todos ellos de pacientes de cáncer de colon con consentimiento firmado, que habían sufrido una resección quirúrgica en el hospital The First Affiliated Hospital, Universidad de Sun Yat-sen (Guangzhou, China). Estas piezas fueron diagnosticadas mediante análisis patológico. Todos los tejidos fueron congelados inmediatamente en nitrógeno líquido y conservados a -80 ºC hasta su uso. El Comité de Evaluación de Investigación del The First Affiliated Hospital, Universidad Sun Yat-sen, supervisó y aprobó este estudio.

Cultivo celular

La línea de células epiteliales de colon normal humanas NCM460 y las líneas de células de cáncer de colon HCT116, HT-29, SW480 y SW620 se obtuvieron del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de las Ciencias (Shanghái, China).  Se mantuvo NCM460 en el medio Dulbecco Modified Eagle Medium (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.). Se cultivó HCT116 y HT-29 en el medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.). LoVo se cultivó en el medio de cultivo Ham F-12 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). SW480 y SW620 se mantuvieron en el medio L-15 (Gibco). Estas células de mantuvieron en los medios descritos arriba, adicionado con un 10% de suero fetal bovino (Gibco) a 27 ºC en una incubadora humidificada con CO₂ al 5%.

Aislamiento de RNA y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

El RNA total se aisló de los tejidos y las células señalados con TRIzol Regent (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El RNA aislado se trató con DNase I (Takara, Dalian, China) para eliminar el DNA genómico. Seguidamente, se realizó la transcripción inversa mediante el uso de RNA y la transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Los ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizaron con SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara) con el sistema ABI StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), según los protocolos del fabricante. Se usó β-actina como testigo endógeno para la cuantificación de mRNA y de lncRNA. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes: para la variante de transcripción 1 de B3GALT5-AS1, 5′- ATTTCACGGATGAGACGAC-3’ (directo) y 5′- CCTTGAGAGACGAAGCAC-3’ (inverso); para la variante de transcripción 2 de B3GALT5-AS1, 5′- TCACGGATGAGACGACTC-3’ (directo) y 5′- AAGGCTTCCAAACACGAAAA-3’ (inverso); para cadherina-E, 5′-GCCCCATCAGGCCTCCGTTT-3’ (directo) y 5′- ACCTTGCCTTCTTTGTCTTTGTTGGA-3’ (inverso); para cadherina-N, 5′-TGGACCATCACTCGGCTTA-3’ (directo) y 5′-ACACTGGCAAACCTTCACG-3’ (inverso); para ZEB2, 5′-TGAGGATGACGGTATTGC- 3’ (directo) y 5′-ATCTCGTTGTTGTGCCAG-3’ (inverso); para SNAI2, 5′-GGCAAGGCGTTTTCCAG-3’ (directo) y 5′-CAGCCAGATTCCTCATGTTT-3’ (inverso); y para β-actina, 5′- GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’ (directo) y 5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’ (inverso).

Para la cuantificación de miRNA, se realizó qRT-PCR según descrito anteriormente con ensayos TaqMan microRNA según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). U6 sirvió como testigo endógeno para la cuantificación de miRNA. La cuantificación de RNA se calculó con el método comparativo Ct.

Western blot

Se aislaron las proteínas totales de los tejidos o células mediante el tampón de extracción RIPA (Beyotime, Shanghái, China). Se separaró una cantidad idéntica de muestras de proteína mediante el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Entonces se transfirieron las proteínas al filtro de membrana de nitrocelulosa (Milipore, Bedford, MA, EE.UU.). Seguidamente se bloquearon las membranas con albúmina sérica bovina y se incubaron con anticuerpos primarios contra β-actina (Sigma-Aldrich), cadherina-E (Abcam, Hong Kong, China) o cadherina-N (Abcam). Tras tres lavados con tampón TBS, las membranas fueron incubadas con IRdye 700 – conjugado con IgG de cabra anti-ratón o IRdye 800 – conjugado con IgG de cabra anti-conejo (Li-Cor, Lincoln, NE, EE.UU.). Finalmente se detectaron bandas inmunorreactivas usando imagen infrarroja Odyssey (Li-Cor).

Construcción de plásmidos

Para la construcción de diferentes plásmidos B3GALT5-AS1 con expresión aumentada, se ampliaron con PCR los nucleótidos de longitud completa B3GALT5-AS1, los nucleótidos 1-1061 de B3GALT5-AS1 y los nucleótidos 1062-1363 de B3GALT5-AS1 con Thermo Scientific Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Entonces se subclonaron los productos de PCR en los sitios Hind III y Xba I, Hind III y BamH I, o BamH I y Xba I del plásmido pcDNA3.1 (Invitrogen), que se designaron como pcDNA3.1-B3GALT5-AS1, pcDNA3.1-B3GALT5-AS1-∆B, pcDNA3.1-B3GALT5-AS1-B respectivamente. Las secuencias de los cebadores PCR son las siguientes: para pcDNA3.1-B3GALT5-AS1, 5′-CCCAAGCTTGACGCGGCGGGCGGCTCC-3’ (directo) y 5′-GCTCTAGAAATTTTACTTTTTTTGGAGACAGGG-3’ (inverso); para pcDNA3.1-B3GALT5-AS1-∆B, 5′- CCCAAGCTTGACGCGGCGGGCGGCTCC-3’ (directo) y 5′- CGGGATCCTATGGAGGTTCTGTTTGCTTCTGCA- 3′ (inverso); para pcDNA3.1-B3GALT5-AS1-B, 5′- CGGGATCCAAATGTAATGATGTCTTGTGCC-3′ (directo) y 5′- GCTCTAGAAATTTTACTTTTTTTGGAGACAGGG- 3′ (inverso). El plásmido vacío pcDNA3.1 se empleó como testigo negativo. Se insertaron dos pares de oligonucleótidos cDNA supresores de la expresión de B3GALT5-AS1 en el plásmido de expresión SuperSilencing shRNA pGPU6/Neo (GenePharma, Shanghái, China), designados como sh-B3GALT5-AS1-1 y sh-B3GALT5-AS1-2. Los sitios diana son 5′- GCAAGACAGCGCATTGATTGG-3′ y 5′-GCATAAGAGAGACCAACTTGG-3′, respectivamente. Se empleó un shRNA de secuencia aleatoria como testigo negativo con la designación sh-NC. El promotor de miR-203 que contenía los sitios de unión previstos de B3GALT5-AS1 se amplificó mediante Thermo Scientific Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix y se subclonó en los sitios Kpn I y Hind III del plásmido pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, EE.UU.), reportero de la luciferasa de luciérnaga, denominado pGL3-miR203-pro. Las secuencias de los cebadores PCR son las siguientes: 5′- GGGGTACCTCCTCTCCATCACGACTACT-3′ (directo)        y 5′- CCCAAGCTTGTTTCTGCTTCTCAGACCCT-3′ (inverso).

Construcción de líneas de células estables

Para la construcción de células HCT116 con expresión aumentada estable de B3GALT5-AS1, se transfectó pcDNA3.1-B3GALT5- AS1, pcDNA3.1-B3GALT5-AS1-∆B, o pcDNA3.1 en las células HCT116 con Lipofectamine 3000 (Invitrogen) según los protocolos del fabricante. Seguidamente, las células se seleccionaron con neomicina durante cuatro semanas. Para la construcción de células SW620 con B3GALT5-AS1 reducido de forma estable, se transfectó sh-B3GALT5-AS1-1, sh- B3GALT5-AS1-2, o sh-NC en células SW620 con Lipofectamina 3000 (Invitrogen). Seguidamente, las células se seleccionaron con neomicina durante cuatro semanas. Se adquirieron lentivirus recombinantes, que contenían el inhibidor de miR-203 o el testigo, de GenePharma (Shanghái, China). Se transfectaron células SW620 de B3GALT5-AS1 reducido de forma estable con 2×106 unidades de transducción de lentivirus inhibidores de miR-203 y se seleccionaron con puromicina durante cuatro semanas. Las líneas de células estables se identificaron mediante qRT-PCR.

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular se determinó con el ensayo de viabilidad celular Glo y con el ensayo de incorporación de etinil desoxiuridina (EdU). Para los ensayos de viabilidad celular Glo, se cultivaron 2000 células de cáncer de colon por pocillo sobre placas de 96 pocillos y se mantuvieron el tiempo indicado. Al final del periodo de incubación, se midieron los valores de luminiscencia con CellTiter-Glo® Luminescent Cell  Viability  Assay (Promega), según el protocolo del fabricante. Los ensayos de incorporación (EdU) se llevaron a cabo con el kit EdU (Roche, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Los resultados se obtuvieron con el fotomicroscopio de fluorescencia Zeiss (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) y se midieron con el recuento de al menos diez campos aleatorios.

Ensayos de migración e invasión celular

Se evaluó la migración y la invasión mediante ensayos Transwell. Para el ensayo Transwell de migración se volvieron a suspender 40.000 células de cáncer de colon señaladas en un medio libre de suero con 1 μg/ml de mitomicina C para reprimir la proliferación celular y se sembraron en la cámara superior de los pocillos Transwell (Millipore). Las cámaras inferiores se suplementaron con un 10% de FBS. Tras una incubación de 24 horas se retiraron meticulosamente las células cancerosas que permanecían en las cámaras superiores. Las células cancerosas que habían migrado a través de las membranas se fijaron en metanol, se tiñeron con cristal violeta al 0,1% y se tomaron imágenes con el fotomicroscopio de fluorescencia Zeiss (Carl Zeiss). Se midieron los resultados mediante recuento de al menos diez campos aleatorios. Los ensayos de invasión de Transwell se realizaron con el Cell Invasion Assay Kit de CHEMICON (Millipore) según el protocolo del fabricante. Los resultados se analizaron como ensayo de migración Transwell.

Purificación de RNA citoplasmático y nuclear

El RNA citoplasmático y nuclear se purificó con Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit (Norgen, Belmont, CA, EE.UU.) según el protocolo del fabricante.  El RNA purificado se midió mediante qRT-PCR.

Aislamiento de cromatina por purificación de RNA (ChIRP)

Se realizó el ChIRP mediante Magna ChIRP RNA Interactome Kit (Millipore) según el protocolo del fabricante. Se sintetizaron sondas antisentido DNA específicas para B3GALT5-AS1 por parte de Biosearch Technologies. Las secuencias de las sondas son las siguientes: 1, 5′-aaactcaaagaaccggcctc-3′; 2, 5′-ggcatctggggtttgagaag-3′;  3,  5′-ttgcatgactttggctcatt-3′;  4, 5′-taagtattgctccagcattc-3′;  5,  5′-gaagatagcctctctgacag-3′; 6, 5′-atacctcttttgacagagct-3′; 7, 5′- cacctcaaaggatgatcaa-3′; 8, 5′-ttctgcaccttggtctaatc-3′. El DNA enriquecido por ChIRP se midió mediante qRT-PCR para determinar el enriquecimiento del promotor miR-203. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: 5′- ACTGGGAAGATGGAGGTTG-3′ (directo) y 5′-GATGGAAGTGGGCATAGGG-3′ (inverso).

Medición de la actividad luciferasa mediante Dual Luciferase Reporter Assay

El reportero de la luciferasa construido pGL3-miR203-pro se cotransfectó con el vector de expresión de renilla luciferasa pRL-TK en las células señaladas SW620. Los diversos plásmidos de expressión B3GALT5-AS1 se transfectaron con pGL3-miR203-pro y pRL-TK en células HCT116. Se detectó la actividad luciferasa cuarenta y ocho horas tras la transfección mediante Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega), según el protocolo del fabricante.

Experimentación animal

Para establecer un modelo de metástasis hepática in vivo, se inyectaron 2×106 de las células de cáncer de colon marcadas en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato via intraesplénica en ratones lampiños de seis semanas, adquiridos en el Laboratory Animal Center de la Universidad Sun Yat-sen (Guangzhou, China). Los ratones fueron alojados en unas instalaciones para animales con temperatura y luz controladas, con libre acceso al alimento y al agua para crecer durante seis semanas. Al cabo de este tiempo, se sacrificaron los ratones y se resecó el hígado. Los hígados resecados se fijaron en formalina, se incluyeron en parafina, fueron desparafinados, rehidratados y se recuperaron los antígenos. El recuento de los focos metastásicos hepáticos se realizó mediante tinción con hematoxilina y eosina (HE). Se incubaron las secciones con anticuerpo primario específico para Ki67 (Abcam) y peroxidasa de rábano picante, conjugado con anticuerpo secundario (Beyotime, Shanghái, China), segiudo por su visualización con 3, 3- diaminobencidina. El comité de bienestar y uso de los animales del The First Affiliated Hospital, Universidad de Sun Yat-sen, revisó y aprobó los protocolos del ensayo relativos a la gestión de los ratones.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism software (PraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). Se llevaron a cabo, según se indica en cada caso, prueba t de Student, prueba de rango con Wilcoxon, prueba de chi cuadrado de Pearson, análisis correlacional Pearson o log-rank. Los valores p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Abreviaturas

lncRNA, RNA no codificante largo; miR-203, microRNA-203; TEM, transición epitelio mesénquima; TME, transición mesénquimo epitelial; miRNA, microRNA; qRT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real; SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico; EdU, etinil deoxiuridina; ChIRP, aislamiento de cromatina por purificación de RNA; HE hematoxilina y eosina.

Contribución de los autores

YH, LW y ZW diseño del estudio; LW, ZW, KW, WD, CZ y JP realizaron los experimentos; YH, LW y ZW recogida y análisis de datos. YH y LW redactaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

CONFLICTO DE INTERESES

Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Material adicional

Figura S1. La expresión de las variantes de transcripción de B3GALT5-AS1 en cáncer de colon. La expresión de B3GALT5-AS1 en dos pares de tejidos de cáncer de colon primario y de los tejidos epiteliales normales de colon adyacentes se midió con qRT-PCR. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. **P < 0.01, NS, no significativo, prueba t de Student.

Figura S2. El silenciamiento de B3GALT5-AS1 promovía la proliferación e inhibía la migración, invasión y la TEM de las células NCM460. (A) Tras la transfección transitoria de shRNA específico B3GALT5-AS1 o testigo en células NCM460, se detectó la expresión de B3GALT5-AS1 mediante qRT-PCR. (B) Tras la transfección transitoria de shRNA específico B3GALT5-AS1 o testigo en células NCM460, se detectó la viabilidad celular mediante ensayos de viabilidad celular Glo. (C) Tras la transfección transitoria de shRNA específico B3GALT5-AS1 o testigo en células NCM460, se detectó la proliferación celular mediante ensayo de incorporación EdU. El color rojo indica células EdU positivas. Escala de barras = 100 μm. (D) Tras la transfección transitoria de shRNA específico B3GALT5-AS1 o testigo en células NCM460, se detectó la migración celular mediante ensayo de migración Transwell. Escala de barras = 100 μm. (E) Tras la transfección transitora de shRNA específico B3GALT5-AS1 o testigo en células NCM460, se detectó la invasión celular mediante ensayo de invasión Transwell.  Escala de barras = 100 μm.  (F) Tras la transfección transitoria de shRNA específico B3GALT5-AS1 o testigo en células NCM460, se detectó la expresión de cadherina-E y cadherina-N mediante qRT-PCR. Los resultados se exponen como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, prueba t de Student.

Figura S3. El potencial de unión entre B3GALT5-AS1 y los promotores de miRNA relacionados con la TEM. (A) El potencial de unión entre B3GALT5-AS1 y los promotores de miRNA se predijo mediante Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). (B) Boceto esquemático de los sitios de interacción previstos entre B3GALT5-AS1 (query) y el promotor de miR-203 (subject).

Artículo original:

Wang L, Wei Z, Wu K, Dai W, Zhang C, Peng J, He Y. Long noncoding RNA B3GALT5-AS1 suppresses colon cancer liver metastasis via repressing microRNA-203. Aging (Albany NY). 2018; 10:3662-3682. https://doi.org/10.18632/aging.101628